微量丙二醛(MDA)测试

一、测试原理：

过氧化脂质降解产物中的丙二醛（MDA）可与硫代巴比妥酸（TBA）缩合，形成红色产物,在532nm处有最大吸收峰。因底物为硫代巴比妥酸（ThibabituricAcidTBA）所以此法称TBA法。

二、测试所需仪器耗材和试剂：

含532nm波长的分光光度计(上海美析仪器有限公司)及1cm光径比色皿（或酶标仪及96孔板）、95℃水浴锅、电炉（配试剂加热用）、台式低速离心机、各种规格移液器、双蒸水、无水乙醇、生理盐水（0.9%）或PBS（0.1M）、冰醋酸（分析纯，乙酸浓度≥99.5%）、涡旋混匀器、离心管、蛋白测定试剂（组织及细胞样本用，本公司有售）。

三、试剂盒组成与配制:(试剂盒有效期1年)

四、规范操作方法：

1、样本前处理：

血清（浆）样本：直接使用；

细胞培养液样本：取部分3500rpm/分钟离心10分钟后取上清待测；

组织样本：称取组织重量，按照重量（g）:体积(mL)=1:9的比例加入9倍体积生理盐水，剪碎组织，冰水浴制备成匀浆液待测（匀浆液也可3500rpm/分钟离心10分钟后取上清（10%匀浆上清）测定，此时上清液需要同时测定其蛋白浓度，计算时用公式（3））；

培养细胞样本：

收集细胞：①、悬浮培养的细胞，可直接通过离心收集沉淀细胞（1000转/分，离心10分钟，弃上清留沉淀细胞）；②、贴壁培养的细胞，吸去上清，可通过细胞刮直接将细胞刮下；或者是用0.25%的胰酶室温消化2～3分钟，加培养液终止消化，用微量移液器轻轻吹打，将所有液体吸出转入EP管，然后1000转/分，离心10分钟弃上清，留沉淀细胞，再加入1mLPBS轻轻吹打，再次1000转/分，离心10分钟弃上清，留沉淀细胞待用。如暂时不做，则可以将细胞低温冻存，温度越低越好。

细胞破碎：（以下任选一种）（破碎后可以用本所的BCA或考马斯亮蓝试剂盒测定蛋白浓度，用于计算）

①、研磨破碎：在细胞沉淀中加入一定量（106数量级的细胞一般加0.3～0.5mL）的缓冲液（缓冲液可以用PBS或者是生理盐水），用手动玻璃匀浆器冰水浴研磨3～5分钟，或者是用卡富隆电动研磨器冰水浴研磨3分钟待测；

②、超声破碎：在细胞沉淀中加入一定量（106数量级的细胞一般加0.3～0.5mL）的缓冲液（缓冲液可以用PBS或者是生理盐水），需保证超声探头在液面以下。功率300W，冰水浴，每3～5S超声一次，间隔4次（每次间隔时间为30S左右）；（推荐此法）

③、反复冻融：可以用液氮进行反复冻融，让细胞在EP管或者是冻存管中加入一定量的低渗液或者蒸馏水，直接放入液氮中3～5秒，立即提出转入-20℃冰箱（20～30秒），再取出室温解冻，解冻后再按前面重复3次。（注意从液氮中取出不可直接置于室温解冻，这样EP管等容易炸裂导致样本损失，所以一定要用冷冻进行梯度解冻）；

④化学裂解：贴壁培养的细胞，可直接将上清吸去后，直接在孔板或是瓶中加入一定量的裂解液（推荐用1%-2%的TritonX-100，覆盖满细胞），置冰上裂解30～40分钟（可用显微镜观察细胞破碎情况，如效果不好可延长时间），再用微量移液器吸出待测。

2、操作表：

注：①、对照管每个样本都需要做，表内所有试剂可以按比例增大或缩小，结果不变。

②、细胞匀浆液或细胞培养上清液可上样0.3～0.4mL。

③、规范操作方法标准管参考吸光度：标准管吸光度减去空白管的吸光度为0.130～0.140（1cm光径），用酶标仪读数时，此值在0.075～0.090。

④、预试时，若发现检测样本吸光度太低，正式实验时可以将水浴时间40分钟延长至80分钟，但同一课题中MDA的水浴都必须用80分钟，以免造成批间差异。

3、计算公式：

（1）、血清（浆）、细胞培养液中MDA含量计算公式：

（2）、组织中MDA含量计算公式：

（3）、细胞或组织匀浆上清中MDA含量计算公式：

注：